• Вітамін В12 > Вимірювання кількості вітаміну B12: чому така плутанина?



    Вимірювання кількості вітаміну B12: чому така плутанина?


    Зміст

    • Короткий огляд
    • Вимірювання кількості В12 і його активності
    • Методи вимірювання кількості В12
      • Мікробіологічний аналіз
      • Аналіз R-білка
      • Аналіз Внутрішнього фактора (фактор Касла)
        • Аналіз Внутрішнього фактора (фактор Касла) не є надійним для людей
      • Ochromonas Malhamensis краще, ніж аналіз Внутрішнього фактора
      • Паперова хроматографія
    • Методи вимірювання активності B12 в їжі
      • Покращення при макроцитарній анемії
      • Зниження рівня гомоцистеїну
      • Зниження рівня метилмалоновой кислоти (ММК) – золотий стандарт
    • Бактеріальне забруднення
    • Використана література

    Короткий огляд

    Неактивні аналоги вітаміну В12 в рослинній їжі можуть вплинути на точність вимірювання при використанні традиційних методів визначення рівня вітаміну В12 і наявності його активної форми в конкретній їжі. Бактеріальне забруднення їжі може скласти враження, що всі такі продукти містять активні аналоги В12. Єдиний надійний спосіб визначити, чи має той чи інший продукт активну форму В12, – перевірити, чи знижує він рівень метилмалонової кислоти в організмі людини.

    Вимірювання кількості В12 і його активності

    Дуже важливо розуміти різницю між кількістю В12 і його активністю в їжі. Традиційно застосовується кілька методів для вимірювання кількості В12:

    • Мікробіологічний аналіз
    • Аналіз R-білка
    • Аналіз Внутрішнього фактора (фактор Касла)
    • Паперова хроматографія

    Є також кілька методів для вимірювання активності В12:

    • Поліпшення при макроцитарній анемії
    • Зниження рівня гомоцистеїну
    • Зниження рівня метилмалоновой кислоти (ММК)

    Методи вимірювання кількості В12

    Мікробіологічний аналіз

    При мікробіологічному аналізі рівень В12 вимірюється шляхом підгодовування певних В12-залежних бактерій і вимірювання їхнього росту. Використовуються різні тест-організми для оцінки В12:

    Таблиця 1. Тест-організми для мікробіологічного аналізу В12
    Організм
    Вид
    Примітка
    Escherichia coli mutant 113-3 (1)
    Бактерія
    Не рекомендується, адже реагує на велику кількість неактивних аналогів В12. (1)
    Lactobacillus leichmannii 326 (1)
    Бактерія
    Може використовувати деякі неактивні кориноїди В12. (1)
    Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830152
    Бактерія
    Нова назва для Lactobacillus leichmannii. (2)
    Euglena gracilis Z-alga (1)
    Найпростіші
    Може використовувати деякі неактивні кориноїди В12. (1)
    Ochromonas malhamensis (1)
    Найпростіші
    Дає найбільш конкретні значення для кобаламінів. (10)
    Arthrobacter Lochhead 38
    Бактерія
    У дослідженні 1959р. виявили, що він схожий на Ochromonas malhamensis. (3)

    Деякі або всі ці бактерії добре ростуть від різних неактивних аналогів В12, що робить їх ненадійними для вимірювання В12 в рослинах, які часто містять неактивні аналоги В12. Незважаючи на це, багато лабораторій, особливо в приватних компаніях, які хочуть продати свій продукт з вмістом В12, користуються цими не надто надійними методами.

    Аналіз R-білка

    Аналіз R-білка вимірює вміст аналогів В12 в їжі, спостерігаючи, скільки їх буде прив'язано до R-білка, який є транспортним білком В12, що міститься в ротовій порожнині і в інших місцях. Відомо, що R-білок прив'язується до неактивних аналогів В12.

    Аналіз Внутрішнього фактора (фактора Касла)

    В межах аналізу Внутрішнього фактора вимірюють вміст аналогів B12 в їжі, спостерігаючи, скільки буде зв'язуватися з Внутрішнім фактором, який є транспортним білком В12, що секретується в шлунку. Протягом декількох років вважалося, що він зв'язується тільки з активними аналогами B12. Насправді при порівнянні кількісної різниці між R-білком і аналізом Внутрішнього фактора можна показати, скільки неактивних аналогів В12 міститься в їжі.

    Аналіз Внутрішнього фактора (фактор Касла) не є надійним для людей

    Дагнільє та ін. (4) (1991, Нідерланди) швидко змінили загальну думку про те, що аналіз Внутрішнього фактора може показати вплив їжі на стан B12. Малюкам на макробіотичному харчуванні (14-26 місяців) з анемією, викликаною дефіцитом B12 (сироваткове значення B12 <184) давали їжу, в якій, з аналізу Внутрішнього фактора, були знайдені деякі аналоги B12. Згідно з дослідженням Дагнільє, всього 0,1 мкг/добу B12 може привести до повної терапевтичної відповіді протягом 1 місяця (4). Через 4-6 місяців після вживання цих продуктів рівень B12 в крові піддослідних збільшився, але анемія була гіршою в дітей-веганів:

    Таблиця 2. Результати дослідження Дагнільє та ін. (4)
    Досліджуваний
    Отримання аналогів В12 мкг/добу
    Джерело аналога В12
    Анемія
    (СОЕ)
    Вегани
    1
    2,7
    спіруліна, норі
    гірше
    2
    2,1
    спіруліна, норі
    гірше
    3
    1,5
    норі
    гірше
    4
    0,3
    норі
    гірше
    5
    0,1
    хліб з дріжджового тіста, морська капуста, ячмінний солодовий сироп
    гірше
    Невегани
    6
    1,5/0,5
    водорості/риба та молоко
    краще
    7
    0,3
    риба
    краще
    8
    0,2
    риба
    краще
    9
    0,2
    риба, молоко
    краще
    10
    0,15
    риба, норі
    гірше
    11
    0,2
    добавки, риба, норі
    гірше
    СОЕ = Середній обсяг еритроцитів

    Імовірним поясненням поганого засвоєння може бути те, що норі, спіруліна і ламінарія або не містять активний В12 зовсім, або містять високу кількість неактивного аналога B12, який перемагає активний, приводячи до загального негативного ефекту. Дагнільє та ін. повідомили: "Абсолютно необґрунтовано називати водорості та інші продукти рослинного походження надійним джерелом вітаміну В12, адже його біодоступність сумнівна".

    Слід зазначити, ґрунтуючись на останніх дослідженнях, що споживання більше 0,3 мкг/добу для немовлят 6-16 місяців недостатньо, щоб запобігти дефіциту В12 (на підставі рівнів ММК) (5). Таким чином, деякі пацієнти в дослідженні Дагнільє та ін., можливо, мали потребу в більшій кількості В12.

    Дослідження Дагнільє та ін. показало, що важливо вимірювати активність B12 в їжі для людини, а не покладатися тільки на вимірювання кількості B12 з використанням аналізів. Ви не будете знати загальну картину напевно, поки не проведете вимірювання для харчових продуктів. Ситуація ускладнюється ще й тим, що партії деяких продуктів можуть мати B12 внаслідок бактеріального забруднення, тоді як інші партії того ж продукту – ні. Темпе є яскравим прикладом.

    Ochromonas Malhamensis краще, ніж аналіз Внутрішнього фактора

    Бейкер та ін. (6) порівняли Ochromonas malhamensis з аналізом Внутрішнього фактора і виявили, що другий дав результат на 44% вище, ніж перший. Автори припускають, що О. malhamensis може бути найбільш ефективним серед інших аналізів на вимір метаболічно активного аналога B12. На жаль, тільки в одному дослідженні змісту B12 в рослинній їжі використовувався О. malhamensis. Проте поки не відомо, чи є зростання О. malhamensis точним показником активності B12 в організмі людини.

    Паперова хроматографія

    Для спрощення інформації слід сказати, що паперова хроматографія – це термін, який використовується тут для позначення масиву методів, які в поєднанні можуть давати визначення точної структури молекули. Ці методи є більш надійними, на відміну від згаданих вище, але вони є важкими для виконання. Крім того, вони не можуть показати фактичну активність B12 в рослинній їжі в цілому, а можуть дати дані тільки про її окремі частини.

    Методи вимірювання активності B12 в їжі

    Покращення при макроцитарній анемії

    Дефіцит В12 може призвести до макроцитарної анемії (до великих еритроцитів). Проте дефіцит фолієвої кислоти також може її викликати. Якщо людина з макроцитарною анемією має хороший рівень фолату, отримує харчування з вмістом B12 і його стан поліпшується, можна не сумніватися, що їжа має певну кількість активного B12, що впливає на червоні кров'яні тільця. На жаль, не відомо точно, чи є активний В12 для клітин крові також активним для нервових клітин. Див. також додатково секцію Неактивні аналоги: гірше, ніж просто даремні в статті "Аналоги В12"

    Зниження рівня гомоцистеїну

    Дефіцит В12 може призвести до підвищення рівня гомоцистеїну в крові. Проте дефіцит фолієвої кислоти або вітаміну В6 може призвести до того ж. Зниження рівня гомоцистеїну може дати гарне уявлення про активність B12 в їжі, але через можливий вплив фолієвої кислоти і В6 на результат це не найточніший тест для визначення активності В12.

    Зниження рівня метилмалонової кислоти (ММК) – золотий стандарт

    В біохімічному процесі зниження рівня ММК в крові бере участь тільки вітамін В12, тож зниження рівня ММК – це найточніший тест для визначення активності В12. Хоча поки точно невідомо і цілком ймовірно, що цей біохімічний процес є невід'ємною частиною функції B12 в нервовій тканині. Якщо якась їжа знижує рівень ММК, то це може говорити про повну активність B12 у ній.

    Бактеріальне забруднення

    Внаслідок того, що деякі бактерії виробляють B12 і можуть жити в середовищі вирощування або забруднювати деякі продукти (наприклад, див. інформацію про темпе), одноразового вимірювання зниження рівня ММК буде недостатньо. Необхідно вимірювати їжу з різних партій і регіонів, приготовану різними способами, щоб переконатися, що В12 справді в ній є.

    Використана література
    ---

    Measuring B12: Why the Confusion?
    Contents

    • Summary
    • B12 Amounts Versus B12 Activity
    • Methods for Measuring Amounts of B12
      • Microbiological Assay
      • R-protein Assay
      • Intrinsic Factor Assay
        • Intrinsic Factor Assay Shown to Be Unreliable in Humans
      • Ochromonas Malhamensis Fares Better Than an Intrinsic Factor Assay
      • Paper Chromatography
    • Methods for Measuring B12 Activity of a Food
      • Macrocytic Anemia Improvements
      • Homocysteine Reduction
      • Methylmalonic Acid (MMA) Reduction: The Gold Standard
    • Bacterial Contamination
    • References

    Summary

    Inactive B12 analogues in plant foods compromise the accuracy of traditional methods used to determine the vitamin B12 amounts and activity of a food. Bacterial contamination of a food can create the false impression that all such foods contain B12 analogues. The only reliable way to determine if a food is a source of active B12 is to test various batches of that food to see if it reduces methylmalonic acid (MMA) levels in humans.

    B12 Amounts Versus B12 Activity

    It is important to distinguish between the amounts of B12 in a food, and the B12 activity of a food. There are a number of ways that have traditionally been used to measure B12 amounts:

    • Microbiological Assay
    • R-protein Assay
    • Intrinsic Factor Assay
    • Paper Chromatography

    There are also a number of ways to measure B12 activity:

    • Macrocytic Anemia Improvements
    • Homocysteine Reduction
    • Methylmalonic Acid (MMA) Reduction

    Methods for Measuring Amounts of B12

    Microbiological Assay

    Microbiological assays use a process in which B12 is measured by "feeding" a food to certain B12-dependent bacteria and measuring how well they grow. Various test organisms for measuring B12 have been used:

    Table 1. Test Organisms for B12 Microbiological Assays
    Organism
    Organism
    Notes
    Escherichia coli mutant 113-31
    bacteria
    Not recommended because it responds to so many inactive B12 analogues.1
    Lactobacillus leichmannii 3261
    bacteria
    May utilize some inactive B12 corrinoids.1
    Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830152
    bacteria
    New name for Lactobacillus leichmannii2
    Euglena gracilis Z-alga1
    protozoa
    May utilize some inactive B12 corrinoids.1
    Ochromonas malhamensis1
    protozoa
    Most specific for cobalamins.1
    Arthrobacter Lochhead 38
    bacteria
    A 1959 study showed it to be similar to O. malhamensis.3

    Some or all of these bacteria thrive on various inactive B12 analogues, making them unreliable for measuring the B12 content of plants, which often contain a variety of inactive B12 analogues. Despite this, many laboratories, especially those of private companies who want to market their product as containing B12, still use the less reliable of these methods when measuring the B12 content of plant foods and seaweeds.

    R-protein Assay

    The R-protein assay measures the B12 analogue content of a food by seeing how much will bind to R-protein, which is a B12 transport protein found in the mouth and other places. R-protein is known to bind to inactive B12 analogues.

    Intrinsic Factor Assay

    The Intrinsic Factor (IF) assay measures the B12 analogue content of a food by seeing how much will bind to IF, which is a B12 transport protein secreted by the stomach. For a few years, it was thought that IF only binded to active B12 analogues. In fact, the difference in amounts between an R-protein and an IF assay was thought to tell how much inactive B12 analogue a food contained.

    Intrinsic Factor Assay Shown to Be Unreliable in Humans

    Dagnelie et al. (4) (1991, Netherlands) quickly changed the thought that intrinsic factor assays can predict the contribution of foods to B12 status. Macrobiotic toddlers (14-26 months old) with B12 deficient anemia (serum B12<184) were given foods that had been found to have some B12 analogue using IF assays. According to Dagnelie, as little as 0.1 µg/day of B12 can lead to a full therapeutic response in 1 month (4). 4-6 months after eating these foods their serum B12 levels had increased, but the anemia was worse in the vegan children:

    Table 2. Results of Dagnelie et al.4
    Subject
    µg/day of
    B12 Analogue Given
    B12 analogue
    Source
    Anemia
    (MCV)
    Vegans
    1
    2.7
    spirulina, nori
    worse
    2
    2.1
    spirulina, nori
    worse
    3
    1.5
    nori
    worse
    4
    0.3
    nori
    worse
    5
    0.1
    sourdough bread, kombu, barley malt syrup
    worse
    Non-Vegans
    6
    1.5 / 0.5
    algae / fish & milk
    better
    7
    0.3
    fish
    better
    8
    0.2
    fish
    better
    9
    0.2
    fish, milk
    better
    10
    0.15
    fish, nori
    worse
    11
    0.2
    supplement, fish, nori
    worse
    MCV - Mean Corpuscular Volume

    A likely explanation for the poor response is that nori, spirulina, and kombu either contained no active B12 or they contained enough inactive B12 analogue that it overcame the active B12, producing an overall negative effect. Dagnelie et al. say, "It seems unjustified to advocate algae and other plant foods as a safe source of vitamin B12 because its bioavailability is questionable."

    It should be noted that, based on a more recent study, intakes as high as .3 µg/day for infants 6-16 months old are probably not enough to prevent B12 deficiency (based on MMA levels) (5). Thus, some of the patients in Dagnelie et al.'s study above may have needed more B12 for a positive response.

    Degnalie et al's study showed that it is important to measure a food's B12 activity in humans rather than to rely only on measurements of B12 amounts using assays. You simply do not know for sure until you test the food. To make things more complicated, batches of some foods may have B12 from bacterial contamination, while other batches of the same food do not. Tempeh is an example.

    Ochromonas Malhamensis Fares Better Than an Intrinsic Factor Assay

    Baker et al. (6) compared Ochromonas malhamensis to an IF assay and found that IF gave a 44% higher reading than Ochromonas malhamensis. The authors suggest that O. malhamensis may be the most effective of the various assays at measuring metabolically active B12. Unfortunately, only one study on B12 in plant foods has used O. malhamensis . Still, it is not known whether O. malhamensis growth is an accurate measurement of B12 activity in humans.

    Paper Chromatography

    For simplicity, paper chromatography is the term used here to refer to an array of methods that when combined can provide a fairly precise determination of the exact structure of a molecule. These methods are more reliable than those mentioned above, but are difficult to perform. Furthermore, they cannot tell the actual B12 activity of a given plant food as a whole; they can only look at the parts.

    Methods for Measuring B12 Activity of a Food

    Macrocytic Anemia Improvements

    B12-deficiency can cause macrocytic anemia (large red blood cells). However, folate deficiency can do the same. If someone with macrocytic anemia is known to have adequate folate status, and is fed a food thought to have B12, and their anemia improves, it is a fairly safe bet that the food has some B12-activity for red blood cells. Unfortunately, it is not known for sure if B12 that is active for blood cells is always active for nerve cells. See the section Inactive Analogues: Worse than Useless in Vitamin B12 Analogues.

    Homocysteine Reduction

    B12-deficiency can cause elevated homocysteine levels in the blood. However, folate and vitamin B6 deficiency can do the same. Reducing homocysteine levels might give a good idea as to the B12 activity of a food, but because folate and B6 can confound the results, it is not the safest test for determining B12 activity.

    Methylmalonic Acid (MMA) Reduction: The Gold Standard

    Because the biochemical pathway that reduces MMA levels in the blood uses only vitamin B12, lowering MMA levels is a test that is specific for B12 activity. Although it is not known for sure, it is likely that this biochemical pathway is an integral part of B12's nerve tissue function(s). Thus, if a food lowers MMA levels, it can be assumed to provide full B12 activity.

    Bacterial Contamination

    Because some bacteria produce B12 and might live in the growing medium or contaminate some foods (e.g., see section on tempeh) it is not enough simply to test a food one time to see if it reduces MMA levels. Numerous batches of the food from various regions, using various preparation methods, should be tested to make sure the B12 is consistently found in the food.

    References
    ---

    ***

    1. Schneider Z, Stroinski A. Comprehensive B12. New York: Walter de Gruyter, 1987.

    2. Watanabe F, Takenaka S, Kittaka-Katsura H, Ebara S, Miyamoto E. Characterization and bioavailability of vitamin B-12-compounds from edible algae. Journal Of Nutritional Science And Vitaminology. 2002(Oct);48(5): 325-331.3.

    3. Goldberg MK, Hutner SH, Ford JE. Nutrition of a cobalamin-requiring soil bacterium. Can J Microbiol. 1959;3:329-334.

    4. Dagnelie PC, van Staveren WA, van den Berg H. Vitamin B-12 from algae appears not to be bioavailable. Am J Clin Nutr. 1991;53:695-7.   | Link

    5. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes for Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B6, Folate, Vitamin B12, Pantothenic Acid, Biotin, and Choline. Washington, DC: National Academy Press; 2000.

    6. Baker H, Frank O, Khalil F, DeAngelis B, Hutner SH. Determination of metabolically active B12 and inactive B12 analog titers in human blood using several microbial reagents and a radiodilution assay. J Am Coll Nutr. 1986;5(5):467-75.

    Поширити:



  • 0 коммент.:

    Дописати коментар